Caracterización de mecanismos de estrés asociados con apoptosis y señales inmunogénicas en células de melanoma murino tratadas con un extracto de plantas rico en polifenoles

Abstract

El cáncer es una de las principales causas de muerte a nivel mundial, los tratamientos para controlar esta enfermedad se basan en la inducción de la muerte de la célula tumoral. En condiciones fisiológicas esa inducción de muerte celular es inmunológicamente silenciosa (tolerogénica). Sin embargo, durante el tratamiento con algunas terapias antitumorales (como antraciclinas, radioterapia y terapia fotodinámica) se puede generar una muerte celular que estimula la respuesta inmune antitumoral. Esta muerte celular denominada muerte celular inmunogénica (MCI) se caracteriza por el incremento de señales de peligro, entre las que se encuentran la exposición de calreticulina en la membrana celular (Ecto-CRT) y la liberación de ATP y de la proteína HMGB-1 (high mobility group box 1). Se ha descrito que la mayoría de los inductores de MCI, directa o indirectamente inducen estrés oxidativo con la generación de estrés de retículo endoplásmico (RE) y autofagia, para la liberación de señales inmunogénicas. Estos mecanismos de estrés indistintamente pueden contribuir con la sobrevivencia o la inducción de la muerte celular durante el tratamiento, o incluso algunos de ellos favorecen en el microambiente tumoral la generación de células con capacidad inmunosupresora. Debido a la alta resistencia presentada en cáncer como consecuencia del uso de medicamentos que presentan un solo blanco molecular, se han empezado a utilizar combinaciones farmacológicas para tratar de mejorar la muerte celular, en la MCI por ejemplo, se propone combinar fármacos que activen la respuesta al estrés en diferentes organelos para lograr la inducción de todas las señales de peligro. Por otra parte, en la búsqueda de nuevas y eficientes terapias antitumorales que puedan modular positivamente la respuesta inmune, se han venido desarrollando una serie de medicamentos derivados de plantas, los cuales son ricos en polifenoles (compuestos antioxidantes con diferentes actividades antitumorales, antiinflamatorias y antimetastásicas), entre otros . En este sentido, en el grupo de Inmunobiología y Biología Celular de la Pontificia Universidad Javeriana se obtuvo un extracto rico en polifenoles derivado de la planta Caesalpinia spinosa, denominado P2Et. El P2Et ha demostrado tener actividad antitumoral in vitro sobre líneas de cáncer de seno y melanoma, a través de la inducción de apoptosis, autofagia y de señales involucradas con MCI. Estos resultados fueron confirmados en modelos in vivo de cáncer de seno y melanoma en los que se mostró que el tratamiento con P2Et disminuye el tumor de una forma dependiente de la respuesta inmune con la generación de linfocitos T más eficientes y una disminución en células mieloides supresoras. Para determinar cuáles mecanismos utilizan los extractos de plantas ricos en polifenoles como el P2Et y los polifenoles que se asocian a ese tipo de extractos, para favorecer la inducción de MCI, en este trabajo se hizo un análisis mecanístico en donde se evaluó el papel del estrés de retículo y la autofagia en la inducción de muerte celular y en la generación de señales inmunogénicas. Para ello se utilizaron células B16-F10 de melanoma murino, las cuales fueron tratadas con P2Et o con los dos polifenoles más abundantes en el extracto ácido gálico (AG) y etil galato (EG, y se combinaron con inhibidores químicos de estrés de RE y de autofagia. Por otra parte, se generaron clones de células B16-F10 carentes de genes necesarios para la activación de estrés de RE y de autofagia utilizando el sistema CRISPR/Cas9 y se trataron con el extracto y los polifenoles. Cuando se evaluó la inducción de estrés de RE, se observó un incremento significativo en las vías de señalización de PERK e IRE-1alpha con P2Et llamando la atención que no hubo incremento de las especies reactivas de oxígeno. Por otra parte, no se observó incremento en la inducción de estrés de RE con AG y solo un ligero incremento con EG que no fue significativo. La muerte celular mediada por P2Et fue totalmente dependiente de la activación de PERK, que llevo al incremento en los niveles de calcio citoplasmático y a su vez, estos se asociaron con pérdida del potencial de la membrana mitocondrial y la inducción de muerte por apoptosis. Por otra parte, la inhibición de la autofagia aumento la muerte mediada por P2Et y EG, mientras que disminuyó la muerte en células tratadas con AG, sugiriendo que este último induce una autofagia citotóxica. Adicionalmente, se encontró que de los dos polifenoles solo el EG induce señales de MCI pero en menor proporción comparado con P2Et. Interesantemente, se identificó que la vía PERK es necesaria también para la expresión de los tres marcadores de muerte inmunogénica estudiados en células tratadas con P2Et y que la autofagia contribuye con la liberación de CRT y ATP. Estos resultados demuestran que el mecanismo por el cual P2Et induce MCI es diferente a los mecanismos previamente descritos para otros inductores de MCI, además que el uso del extracto complejo es ventajoso frente al uso de los polifenoles aislados, lo cual confirma el potencial que tienen los extractos complejos en el tratamiento del cáncer.