Caracterización genómica, proteómica y de la virulencia de aislamientos clínicos de Cryptococcus neoformans var. Grubii : efecto del hierro y el cobre

Abstract

Caracterización genómica, proteómica y de la virulencia de aislamientos clínicos de Cryptococcus neoformans var. grubii: efecto del hierro y el cobre. Introducción

Durante el desarrollo de la enfermedad fúngica invasiva (EFI), los metales participan de manera importante en la interacción entre los hongos y las células del hospedero: el hierro y el cobre actúan como cofactores en múltiples reacciones enzimáticas. Estos metales en la célula fúngica se relacionan de manera importante con la expresión de factores de virulencia gobernados por metaloproteasas. Por otro lado, en el hospedero, son esenciales en la respuesta eficiente de mecanismos efectores, por ejemplo, en las células del sistema inmunológico. Por lo tanto, el éxito en el establecimiento de la EFI pude depender de la capacidad para competir y adquirir metales del entorno del hospedero. La levadura ambiental C. neoformans forma parte del complejo de especies que causa la criptococosis, una micosis oportunista adquirida por la inhalación de propágulos fúngicos presentes en el ambiente. Es una infección potencialmente fatal que afecta los pulmones y el sistema nervioso central. Esta levadura produce infecciones frecuentemente en individuos inmunocomprometidos, por ejemplo, en pacientes con SIDA, con trasplante de órganos o con terapias inmunosupresoras. Los metales son necesarios para las funciones esenciales celulares y los hongos patógenos han desarrollado maquinarias para equilibrar con precisión la delgada línea entre la adquisición de metales esenciales y la defensa contra la toxicidad de estos. El suministro de estos metales dependiendo del ambiente en que se encuentre la levadura puede ser limitado, por ejemplo, el hierro disponible en hospederos mamíferos es extremadamente bajo y en la naturaleza los óxidos de hierro se forman por pH bajos donde la disolución es extremadamente lenta y es dada por la concentración de oxígeno. Asimismo, el cobre en la naturaleza no se encuentra totalmente disponible, ya que en pH básicos disminuye. Este metal normalmente esta enlazado con la materia orgánica y en hospederos mamíferos es limitado. En Cryptococcus neoformans, una de las funciones que desempeñan los metales como el hierro y el cobre es la regulación de la expresión de factores de virulencia como la cápsula o la producción de melanina, por lo que influyen en la infección sistémica exitosa. Objetivo En principal objetivo de esta tesis es caracterizar el genotipo, la virulencia, el proteoma y el efecto del hierro y del cobre sobre la modulación de la patogenicidad en 29 aislamientos clínicos colombianos de Cryptococcus neoformans var. grubii, con el fin de entender su implicación en la virulencia y aportar nuevos datos que ayuden a la predicción de nuevas dianas antifúngicas.

Resultados 1. Caracterización genotípica, determinación de la variabilidad patogénica, crecimiento capsular, producción de melanina, suceptibilidad antifúngica y variantes no sinónimas de genes asociados, en aislamientos clínicos.

Se genotiparon 29 aislamientos clínicos de C. neoformans var. grubii utilizando el esquema de MLST identificándose 11 secuencias tipo (ST), siendo la ST69 la más frecuente seguida de ST2, ST93 y ST377. A continuación, se evaluó la patogenicidad de los aislamientos en G. mellonella clasificándolas en patogenicidad alta (12), intermedia (10) y baja (7) y se llevó a cabo el análisis de los principales factores de virulencia, como efecto en la cápsula pre y post inoculación en G. mellonella, inducción de la cápsula en MOPS y pigmentación de melanina en L-Dopa. En general en los aislamientos con baja patogenicidad se observaron cápsulas de mayor tamaño (1.730 μm de promedio) respecto a los de alta (0.630 μm) y de intermedia (0.498 μm) patogenicidad. De los 7 aislamientos categorizados con baja patogenicidad se observaron 3 con baja pigmentación, 2 intermedia y 2 con alta pigmentación. También dentro de los aislamientos de alta patogenicidad se incluían aislamientos con todos los niveles de pigmentación, 4 de baja, 3 de intermedia y 5 de alta. Posteriormente, se investigó si con el estudio de las características fenotípicas observadas es posible clasificar los aislamientos clínicos de acuerdo con su patogenicidad. Para ello, se realizó un análisis de componentes principales utilizando las variables de mortalidad, cápsula y pigmentación de melanina, encontrándose relación entre el aumento del tamaño capsular y los aislamientos clasificados como de alta patogenicidad. Además, los aislamientos que se agruparon en las secuencias tipo más frecuentes como la ST69 y ST95 presentaron cápsulas grandes (X:2.42 μm), mientras que los aislamientos de la ST2 y ST377 presentaron cápsulas pequeñas (X:1.03 μm). Seguidamente, se combinaron los datos obtenidos de las variables fenotípicas con genes asociados a los principales factores de virulencia. Tras la secuenciación del genoma completo de los 29 aislamientos clínicos y el análisis de polimorfismos (SNPs) se determinaron 48 variantes no sinónimas asociadas a los fenotipos observados y ubicadas en los dominios funcionales predichos para 39 genes. Entre ellas, se identificaron 48 variantes no sinónimas ubicadas en genes asociados a cápsula, melanina y patogenicidad como PTP1, PMT4, IPK1, PBX2, OVA1 y ROM2; además, en 9 de estos genes los cambios detectados implicaban la aparición de codones de parada.

2. Efecto de hierro y cobre en la patogenicidad, el tamaño capsular y producción de melanina en aislamientos clínicos de alta y baja patogenicidad.

En la segunda parte de la tesis se exploró el efecto de hierro y cobre en el crecimiento de aislamientos clínicos de C. neoformans var. grubii, en su patogenicidad en G. mellonella, el crecimiento capsular y la pigmentación de melanina. La levadura fue capaz de crecer a concentraciones de hasta 50 μM de hierro y 500 μM de cobre. A continuación, se evaluó la patogenicidad tras el precultivo con hierro y cobre de 10 aislamientos clínicos con diferentes perfiles de patogenicidad basal (sin precultivo con los metales). En el 90 % de los aislamientos aumento la patogenicidad con la combinación de 50+500 μM de hierro y cobre respectivamente. Igualmente, se observó un aumento del crecimiento de la cápsula, se aceleró la producción de melanina y se indujo la aparición de células tipo titán.

3. Análisis proteómico de los cambios inducidos por el hierro y el cobre y determinación de variantes genéticas en genes asociados a estos metales en dos asilamientos de baja y alta patogenicidad.

Finalmente, para obtener información de los mecanismos implicados en los rasgos de virulencia inducidos en la combinación con 50 μM hierro y 500 μM de cobre, se realizó un análisis proteómico comparativo de extractos citoplasmático de dos aislamientos clínicos (H0058-I-2807 y H0058-I-3102) con diferente grado de patogenicidad tras su crecimiento en con dichos metales y sin ellos. En el precultivo de 50+500 μM de hierro y cobre se identificaron 1.484 proteínas en el aislamiento clasificado como de baja patogenicidad y 1.549 para el aislamiento de alta patogenicidad. Se detectaron 147 proteínas diferenciales que fueron específicas del precultivo con los metales en los dos aislamientos. Las proteínas diferenciales en el aislamiento de alta. patogenicidad fueron 130 (88 aumentaron y 42 disminuyeron su abundancia) y 198 en el aislamiento de baja patogenicidad (149 aumentaron y 49 disminuyeron su abundancia). Finalmente se detectaron 49 proteínas comunes entre los dos aislamientos: 30 con mayor abundancia, 14 con menor y 5 con diferente cambio según el aislamiento. Las proteínas de los dos aislamientos cultivados en la combinación de hierro y cobre que aumentaron su abundancia están relacionadas entre otros procesos con el estrés celular, tráfico vesicular (Ap-1, Vps35), estructura de la pared celular (Och1, Ccr4, Gsk3), biosíntesis de pigmento (Hem15, Mln2), reparación de ADN (Chk1), transporte de proteínas (Mms2), así como proteína asociada a la SUMOilación (Uba2) y un transportador mitocondrial (Atm1). Por lo tanto, la presencia del precultivo con los metales influye sobre la abundancia de proteínas que están involucradas en la patogenicidad. Conclusiones Los aislamientos clínicos colombianos de C. neoformans var. grubii analizados presentaron diferencias en su capacidad patogénica la cual es multifactorial. Cuando se comparan las características demográficas y fenotípicas de acuerdo con las ST identificadas, queda claro que, en lugar de ser un grupo homogéneo, existe una amplia variabilidad tanto en la capacidad patogénica, como en el tamaño capsular y producción de melanina. Quizás las diferencias patogénicas entre los aislamientos obedezcan a las condiciones ambientales en que el hongo crece, el modelo utilizado y a las condiciones propias del hospedero.

Los datos sugieren que el incremento del tamaño capsular es una variable clave para la diferenciación de aislamientos más o menos patógenas, independientemente del método empleado para su inducción. Históricamente la cápsula ha sido ampliamente estudiada dada su capacidad para modular la respuesta inmune del hospedero y los cambios morfológicos de esta estructura se han relacionado con resistencia antifúngicos y a condiciones de estrés, por lo que este proceso es importante para evadir la muerte por parte de las células fagocíticas. En el estudio genómico de los 29 aislamientos clínicos se identificaron variantes no sinónimas que implican 9 codones de parada en genes relacionados con el polisacárido capsular, la síntesis de melanina, el crecimiento, el mantenimiento de la pared celular, la secreción de vesículas extracelulares o la respuesta a estrés. Sería interesante ahondar en el estudio de las consecuencias a nivel de secuencia y función de proteína producidos por las variaciones genotípicas detectadas.

Responder y adaptarse a una gran cantidad de estímulos ambientales son habilidades claves que necesita C. neoformans para sobrevivir en nichos biológicos diferentes. El metabolismo de hierro y cobre es de gran importancia en la fisiología de esta levadura dado que interviene en distintos procesos biológicos. Esta es la primera investigación en que se combina el hierro y el cobre en el precultivo de aislamientos clínicos de C. neoformans var. grubii. Con esta aproximación, se comprobó que la combinación de estos metales aumentó la patogenicidad, el tamaño capsular, aceleró la producción del pigmento de melanina e indujo células tipo titán. Además, se observaron cambios proteómicos tras el precultivo con la combinación de 50 μM de hierro y 500 μM de cobre. Se detectó un aumento en la abundancia de proteínas relacionadas con respuesta a estrés oxidativo, integridad de pared celular, trafico vesicular, cápsula y melanina. Es interesante resaltar que el marcado aumento de la patogenicidad puede explicarse en parte por los resultados que indican que existe un vínculo entre el precultivo en combinación de hierro y cobre y cambios en proteínas asociadas a la cápsula, melanina, pared celular y tráfico vesicular. Sin embargo, para comprender mejor este proceso y sus mecanismos moleculares en detalle es necesario continuar explorando la dinámica de los metales en la patogenicidad y virulencia en esta levadura.