Estudio de proteínas implicadas en la biosíntesis de pared celular en respuesta a diferentes condiciones de estrés en levaduras : búsqueda de blancos terapéuticos

Abstract

Introducción: La EFI (Enfermedad fúngica invasiva) han aumentado en los últimos años como resultado del incremento de pacientes inmunocomprometidos, siendo de particular interés las causadas por la levadura C. glabrata (segunda especie más prevalente en el mundo causando candidemia), debido a que con alta frecuencia es resistente a los azoles y con un aumento importante a las equinocandinas, provocando fallas terapéuticas y altas tasas de mortalidad. Por esta razón, la búsqueda de nuevos blancos terapéuticos es relevante; una de las estrategias para lograr identificar posibles blancos es el estudio de proteínas esenciales que participen en la respuesta a los fármacos. Objetivo: Este estudio tuvo como objetivo evaluar el efecto de la deleción o inhibición de proteínas implicadas en la biosíntesis de pared celular en respuesta a diferentes condiciones de estrés. Metodología: Se evaluaron mutantes haploinsuficientes de S. cerevisiae para 15 proteínas implicadas en la biosíntesis de la pared celular frente a los fármacos caspofungina, fluconazol y frente a diferentes tipos de estrés (térmico, osmótico, oxidativo, agentes disruptores de la pared celular e inhibición de la vía CaM/CaL), además se determinó la susceptibilidad de C. glabrata al inhibidor de la N-glicosilación TM (Tunicamicina) solo y en combinación con caspofungina. Finalmente, con base a los resultados obtenidos en S. cerevisiae se eligieron 2 proteínas para realizar el diseño bioinformático del sistema CRISPR-Cas9 con el interés de evaluar el fenotipo de los mutantes en aislamientos clínicos de C. glabrata resistentes. Resultados: Se encontró que la deleción de genes asociados con la biosíntesis de manoproteínas conduce a una disminución de la CMI (Concentración mínima inhibitoria) en presencia de caspofungina, además que las proteínas de tipo GPI son importantes en la respuesta al fluconazol, por otro lado, la depleción de alguno de los genes implicados en la biosíntesis o formación de la pared celular genera levaduras con mayor susceptibilidad frente agentes disruptores de esta. Se identificó que la proteína con anclaje GPI Ecm33 participa en la respuesta de la mayoría de las condiciones evaluadas y que la vía de señalización CaM/CaL es importante en la respuesta frente al fluconazol y la TM. Por otro lado, la combinación de TM y caspofungina logro disminuir la CMI en aislados de C. glabrata resistentes. Adicionalmente, se obtuvieron los sgRNA para las proteínas Mnn9 y Ecm33 y el constructo del plásmido pV1382 para la construcción de mutantes mediante el sistema CRISPR-Cas9. 9 Conclusiones: El entendimiento de la dinámica de la pared celular en presencia de fármacos permite una mejor comprensión de la adaptación al estrés generado por estos, en este estudio se encontró que las manoproteínas tienen un rol importante en la respuesta a caspofungina, se observó que la deleción de genes implicados en la biosíntesis de manoproteínas en S. cerevisiae condujo a disminución de la CMI, además en C. glabrata la inhibición de la vía de la N-glicosilación en combinación con caspofungina logró disminuir la CMI en aislados resistentes. Resultados que en conjunto son prometedores pues evidencian que la ausencia de manoproteínas en la pared celular afecta el crecimiento de la levadura, sin embargo, es necesario continuar el estudio en C. glabrata para validar los resultados.