Producción, purificación y caracterización de tres hexosaminidasas lisosomales recombinantes en pichia pastoris

Abstract

La deficiencia o alteración de una proteina homopolimérica o heteropolimérica en el organismo puede causar una de cientos de enfermedades monogénicas conocidas. Las N-acetilhexosaminidasas, lisosomales, son un grupo de enzimas poliméricas formadas por subunidades codificadas por genes diferentes HEXA y HEXB formando tres isoenzimas diferentes: un heteropolímero HexA (ap), y dos homopolímeros HexB y HexS (pp y aa respectivamente). Tay Sachs y Sandhoff, o gangliosidosis GM2, son producidas por la alteración en la actividad de Hex-A o Hex-B respectivamente. Hasta el momento estos trastornos lisosomales no tienen una terapia aprobada, sin embargo, la terapia de reemplazo enzimàtico (TRE) se ha venido estudiando como una posible alternativa viable para este tipo de enfermedades. A la fecha las enzimas aprobadas para TRE han sido enzimas coexpresadas a partir de un solo gen, y han sido obtenidas generalmente en células de mamífero. Sistemas de expresión como los microorganismos han sido evaluados debido a su facilidad de cultivo, su mayor rendimiento de producción y su costo relativamente menor al que genera la producción de enzimas recombinantes en células de mamífero con fines terapéuticos. Las levaduras tienen la capacidad de realizar modificaciones postraduccionales semejantes a las humanas, una ventaja que se debe tener en cuenta para cumplir con los requerimientos mínimos necesarios de pureza y funcionalidad biológica de una enzima nativa. En este estudio las enzimas Hex-A, Hex-B y Hex-S fueron producidas en la levadura metilotrófica Pictiia pastoris, empleando genes optimizados para su expresión. El péptido señal nativo fue retirado, y se mantuvo la señal de secreción (a-Factor) de Saccharomyces cerevísiae. Los genes se subclonaron en el plásmido pPIC9K independientemente. La producción de las enzimas recombinantes se evaluó en muestras extracelulares. En cultivos a 1,65 L las actividades específicas más altas fueron 12.624 U mg'1 para rhHex-A, 10.343 ü mg'1 para rhHex-B y 14.606 U mg'1 para rhHex-S. Estas enzimas recombinantes mostraron estabilidad al ser incubadas a 4 y 37°C durante 48 horas, a pH entre 4,0 y 5,0 y a incubación en suero humano. Todas las proteínas recombinantes fueron internalizadas por líneas celulares HEK293 y fibroblastos normales en cultivo, posiblemente mediada por diferentes vías endocíticas y por receptores de manosa y manosa-6-fosfato. Fue posible visualizar el tráfico intracelular mediante microscopía confocal. Estos resultados mostraron el potencial tanto de P. pastoris GS115 para la producción de proteínas diméricas recombinantes como de las hexosaminidasas lisosomales recombinantes obtenidas en este trabajo como posibles herramientas terapéuticas para ser usadas en TRE.