Purificación de anticuerpos policlonales en gallina (IgG) y conejo (IgG) producidos contra secuencias peptídicas de la enzima n-acetilgalactosamina-6-sulfato sulfatasa (galns) y su aplicación en la implementación de una técnica elisa tipo "sandwich"

Abstract

N-acetilgalactosamina-6-sulfato sulfatasa (GALNS; EC3.1.6.4) es una enzima lisosomal perteneciente a la familia de las sulfatasas humanas. Su deficiencia causa un trastorno conocido como Mucopolisacaridosis tipo IVA (MPS IVA; síndrome de Morquio A). Anticuerpos tipo IgG e IgY específicos contra GALNS pueden ser usados en un ensayo de inmuno-cuantificación para la detección de la enzima. En este trabajo, se produjeron anticuerpos policlonales en conejo (IgG anti-GALNS), utilizando secuencias no conservadas presentes en GALNS y ausentes en otras sulfatasas humanas. Los anticuerpos tipo IgY se purificaron mediante una extracción orgánica y columna tiofílica; posteriormente fueron biotinilados. Las IgGs se purificaron mediante una columna de afinidad (Hi Trap-Protein A). Los procesos de purificación de los anticuerpos (IgG e IgY) fueron evaluados por SDS-PAGE, Western Blot y ELISA indirecta. La electroforesis bajo condiciones no reductoras mostró una única banda correspondiente a los eluídos de los anticuerpos IgY e IgG (180 kDa y 150 kDa, respectivamente). Los anticuerpos producidos contra la enzima GALNS fueron reconocidos mediante la técnica de ELISA indirecta y no se observó reactividad cruzada con la Iduronato-2-sulfato sulfatasa (IDS EC 3.1.6.13), enzima que se utilizó como control. Los anticuerpos producidos contra secuencias peptídicas de GALNS (20 aminoácidos / péptido), fueron capaces de detectar la enzima completa mediante la técnica de Western Blot. La biotinilación de los anticuerpos afectó el reconocimiento de la enzima. La ELISA tipo ?sandwich? está en proceso de implementación, con la combinación de los dos anticuerpos, IgG como anticuerpo de captura e IgY como anticuerpo de reconocimiento, para la determinación de la concentración de la enzima. Esta técnica no sólo depende del reconocimiento de los anticuerpos frente a la molécula de interés, sino de la especificidad y pureza de los anticuerpos, así como de las mejores condiciones que minimicen las reacciones no-específicas y que incrementen la afinidad de la interacción antígeno-anticuerpo.