Caracterización funcional del gen activador yfhA del sistema de dos componentes de Photorhabdus luminescens SL0708 empleando una aproximación de genética inversa

Abstract

Photorhabdus luminescens es una enterobacteria Gram negativa conocida por establecer asociaciones simbióticas con nemátodos del género Heterorhabditis y tener una capacidad entomopatógena en larvas de insectos plaga de cultivos. Para lograr esto, P luminescens es capaz de alternar su ciclo de vida en dos fases. Su fase simbiótica se caracteriza por establecer una asociación mutualista con sus nematodos hospederos, colonizando su intestino, con el fin de sobrevivir a condiciones adversas que se puedan dar en el medio ambiente, teniendo en cuenta que esta bacteria se encuentra en forma de vida libre en el suelo. Su fase patogénica se produce tras la infección de las larvas de insectos plaga por su nemátodo hospedero, momento en que la bacteria es regurgitada en cavidades internas de la larva, dando inicio a un proceso de septicemia causado por diversos factores de virulencia como toxinas o enzimas líticas que inhiben el sistema inmune del insecto plaga, favorecen la colonización sistémica, y generan degradación de los tejidos internos de la larva, lo cual permite a su vez la proliferación del nemátodo dentro de la larva. Dada la existencia de estas dos fases fenotípicamente bien diferenciadas y que presentan actividades proliferativas y metabólicas contrastadas, se hace necesario entender cómo P. luminescens logra sensar las condiciones extracelulares asociadas a cada hospedero, con el fin de ejecutar la regulación génica correspondiente. A nivel molecular, esto requiere sistemas de regulación génica y transducción de señales, acoplados con proteínas sensoras. Entre los principales sistemas que cumplen esta función en bacterias, están los llamados sistemas de dos componentes (SDS), conformados por una proteína sensora transmembranal y un activador de respuesta citosólico, permitiendo responder rápidamente a diversas condiciones extracelulares a las que se ve expuesta la bacteria por medio de la activación de diversos genes blanco. Se ha visto que estos sistemas pueden estar involucrados en el control de la virulencia o de su asociación simbiótica, en la utilización de metabolitos y también en la adaptabilidad de bacterias a varios factores de estrés. Estudios derivados de la secuenciación del genoma de P. luminescens muestran que esta especie comparte homología en algunos genes dentro de este sistema, con los de otras bacterias entomopatógenas y patógenas de animales como Yersinia enterocolitica, o Escherichia coli lo que genera la necesidad de entender que función cumplen dichos genes homólogos dentro de la adaptabilidad y virulencia de P. luminescens. En particular, entre los diferentes sistemas de dos componentes presentes en el genoma de P. luminescens, existe el sistema yfhK/yfhA, el cual, a pesar de presentar cierta homología con sistemas encontrados en bacterias patógenas de animales, no se sabe aún su función exacta y se cree que podría estar involucrado en la regulación de ciertos factores de virulencia de la bacteria. Teniendo en cuenta esto, el objetivo de este trabajo fue caracterizar funcionalmente el gen yfhA de P. luminescens por medio de una estrategia de genética inversa. Para lograr esto se buscó validar por medio de PCR y southern blot, la mutagénesis dirigida (knock out) del locus yfhA (plu 3311) de la cepa de P. luminescens SL0708, tras lo cual se procedió a una caracterización fenotípica del mutante generado con respecto a la cepa silveste (wild type) por medio de bioensayos destinados a evaluar actividades asociadas con virulencia y patogenicidad. Los resultados muestran diferencias significativas en tasas de crecimiento, patogenicidad frente a larvas de Galleria mellonella y Tenebrio molitor, actividad antimicrobiana, actividad ureasa, asimilación de citrato y iones de amonio como fuente de nitrógeno, actividad hemolítica y formación de biopelícula, permitiendo concluir que el activador YfhA del sistema de dos componentes yfhK/yfhA se encuentra involucrado en la regulación de la patogenicidad y virulencia de P. luminescens.