Producción de dos hexosaminidasas recombinantes en Pichia pastoris NRRLY-11430 nativa y NRRLY-11430/ΔOCH1 regulada bajo el promotor AOX1

Abstract

Las β-N-acetilhexosaminidasas (EC 3.2.1.52) son enzimas lisosomales que actúan sobre los residuos N-acetilglucosamina o N-acetilgalactosamina de glucoconjungados como esfingolípidos, la enzima hexosaminidasa A está conformada por las subunidades α y β, las cuales son codificadas por los genes HEXA y HEXB respectivamente, mientras que la enzima hexosaminidasa B está conformada por dos subunidades beta. Mutaciones en cualquiera de estos genes, causan la acumulación de sustratos no hidrolizaevaludos en el lisosoma de la célula generando daño y toxicidad celular. Mutaciones en el gen HEXA causan la enfermedad de Tay Sachs o variante B y mutaciones en el gen HEXB puede presentar enfermedades como Sandhoff o variante 0, las cuales cursan con afectación principalmente del sistema nervioso central. No existe actualmente terapia aprobada para el tratamiento de estas patologías, sin embargo, se estudian alternativas terapéuticas para su control, dentro de las cuales se encuentra la terapia de reemplazo enzimático, la cual ha sido aprobada para otras enfermedades de depósito lisosomal. En este estudio, se realizó la transformación de la levadura Pichia pastoris NRRLY11430/nativa y NRRLY11430/ΔOCH1, con el plásmido pPIC9K clonado con cada uno de los genes que codifican para las subunidades anteriormente mencionadas, con el fin de evaluar el potencial de estas cepas en la producción de estas hexosaminidasas recombinantes a escala de 10 y 100 mL en medio BMMY. Los resultados mostraron actividades máximas de 153,466 U/mL para la enzima hexosaminidasa B (hora 72) y 5,829 U/mL para la enzima hexosaminidasa A (hora 72), por parte de la cepa NRRL/ΔOCH1. Adicionalmente, mediante la técnica de western blot se identificaron bandas a una altura de 58 y 63 KDa en la proteína obtenida a partir de la expresión del clon 9 NRRL/ΔOCH1/HEXA, peso que es cercano al reportado para las Hexosaminidasas nativas, mientras que el peso identificado para la enzima producida en P. pastoris GS115 fue entre 68 y 80 KDa, sugiriendo un patrón de glicosilación más alto. Esto sugiere que la cepa NRRLY11430/ΔOCH1 podría ser una sistema adecuado para la obtención de hexosaminidasas recombinantes más similares a las humanas, las cuales, una vez sean optimizadas en cuanto a condiciones de cultivo, podrían ser usadas en futuros procesos de carácter terapéutico.