Establecimiento de un sistema de puntaje semi-automático para ensayos histoquímicos e inmunohistoquímicos con el fin de evaluar diferenciación condrogénica in vitro
Estabelecimento de um sistema de pontuação semi-automático para ensaios histoquímicos e imuno-histoquímicos para avaliar diferenciação condrogênica in vitro
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Autor
Gutiérrez, María Lucía; Instituto de Errores Innatos del Metabolismo. Facultad de Ciencias. Pontificia Universidad Javeriana. Bogotá, D.C.,
Guevara, Johana; Instituto de Errores Innatos del Metabolismo. Facultad de Ciencias. Pontificia Universidad Javeriana. Bogotá, D.C., Colombia
Barrera, Luis Alejandro; Instituto de Errores Innatos del Metabolismo. Facultad de Ciencias. Pontificia Universidad Javeriana. Bogotá, D.C.,
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Durante o desenvolvimento embrionário os membros emergem a partir da condensação de células mesenquimais e sua diferenciação em condrócitos em um processo chamado condrogênese. Estes condrócitos sintetizam glicosaminoglicanos, desempenhando um papel importante neste processo. Existe um sistema de condrogénese in vitro utilizando células mesenquimatosas, geralmente avaliado por histoquímica. Objetivo. Estabelecer um sistema de pontuação semi-automático para ensaios histoquímicos e imuno-histoquímicos. Materiais e métodos. Na condrogênese as células foram cultivadas com meio indutor em agregados, durante três semanas. Os glicosaminoglicanos totais foram determinados pelo azul de dimetileno. Para a análise histológica os agregados foram corados com Azul Alciano e imuno-histoquímica para detecção de agrecan. A pontuação semi-automática foi obtida utilizando o programa ImageJ. Resultados. As células mesenquimais cultivadas em meio de diferenciação condrogênica tiveram uma concentração de proteína comparável durante as três semanas de cultura, o que sugere uma celularidade similar. A concentração de glicosaminoglicanos foi maior para os agregados cultivados em meio condrogênico. A mesma tendência foi observada para a coloração com Azul Alciano segundo as pontuações do observador cego e a análise com ImageJ. Finalmente, os resultados de imuno-histoquímica de pontuações dados pelo observador e aqueles dados pela análise ImageJ revelaram uma tendência decrescente ao longo do tempo para os agregados em meio condrogênico. Conclusão. Nós realizamos um sistema funcional para gerar pontuação semi-automática para diferenciação condrogênica. Nós corroboramos esses resultados por análise bioquímica com resultados comparáveis. Segundo nosso conhecimento, este é o primeiro estudo a avaliar esta metodologia, que pode ser útil para outras aplicações no campo biológico ou médico.Palavras-chave: células mesenquimais, condrogênese in vitro, glicosaminoglicanos, ImageJ.Durante el desarrollo embriológico las extremidades surgen de la condensación de células mesenquimales y su diferenciación a condrocitos en un proceso llamado condrogénesis. Estos condrocitos sintetizan glicosaminoglicanos, jugando un papel importante durante este proceso. Existe un sistema de condrogénesis in vitro utilizando células mesenquimales generalmente evaluado mediante histoquímica. Objetivo. Establecer un sistema de puntaje semi-automático para ensayos histoquímicos e inmunohistoquímicos. Materiales y métodos. Para condrogénesis las células fueron cultivadas con medio inductor en agregados por tres semanas. Los glicosaminoglicanos totales fueron determinados mediante azul de dimetileno. Para el análisis histológico los agregados fueron teñidos con azul de alcian e inmunohistoquímica para detección de agrecán. La puntuación semi-automática fue obtenida utilizando el programa ImageJ. Resultados. Las células mesenquimales cultivadas en medio de diferenciación condrogénica tuvieron una concentración de proteína comparable durante las tres semanas de cultivo, sugiriendo una celularidad similar. La concentración de glicosaminoglicanos fue superior para los agregados cultivados en medio condrogénico. La misma tendencia fue observada para la tinción de azul de alcian mediante puntajes del observador ciego y análisis con ImageJ. Finalmente, los resultados de inmunohistoquímica de puntajes asignados por el observador y los del análisis por ImageJ revelaron una tendencia decreciente con el tiempo para agregados en medio condrogénico. Conclusión. Desarrollamos un sistema funcional para generación de puntaje semi-automático para diferenciación condrogénica. Corroboramos estos resultados mediante análisis bioquímico con resultados comparables. En nuestro saber este es el primer reporte en evaluar esta metodología, la cual puede ser útil para otras aplicaciones en el campo biológico o médico.Palabras clave: células mesenquimales, condrogénesis in vitro, glicosaminoglicanos, ImageJ.