Establecimiento de un sistema de puntaje semi-automático para ensayos histoquímicos e inmunohistoquímicos con el fin de evaluar diferenciación condrogénica in vitro

Abstract

Durante el desarrollo embriológico las extremidades surgen de la condensación de células mesenquimales y su diferenciación a condrocitos en un proceso llamado condrogénesis. Estos condrocitos sintetizan glicosaminoglicanos, jugando un papel importante durante este proceso. Existe un sistema de condrogénesis in vitro utilizando células mesenquimales generalmente evaluado mediante histoquímica. Objetivo. Establecer un sistema de puntaje semi-automático para ensayos histoquímicos e inmunohistoquímicos. Materiales y métodos. Para condrogénesis las células fueron cultivadas con medio inductor en agregados por tres semanas. Los glicosaminoglicanos totales fueron determinados mediante azul de dimetileno. Para el análisis histológico los agregados fueron teñidos con azul de alcian e inmunohistoquímica para detección de agrecán. La puntuación semi-automática fue obtenida utilizando el programa ImageJ. Resultados. Las células mesenquimales cultivadas en medio de diferenciación condrogénica tuvieron una concentración de proteína comparable durante las tres semanas de cultivo, sugiriendo una celularidad similar. La concentración de glicosaminoglicanos fue superior para los agregados cultivados en medio condrogénico. La misma tendencia fue observada para la tinción de azul de alcian mediante puntajes del observador ciego y análisis con ImageJ. Finalmente, los resultados de inmunohistoquímica de puntajes asignados por el observador y los del análisis por ImageJ revelaron una tendencia decreciente con el tiempo para agregados en medio condrogénico. Conclusión. Desarrollamos un sistema funcional para generación de puntaje semi-automático para diferenciación condrogénica. Corroboramos estos resultados mediante análisis bioquímico con resultados comparables. En nuestro saber este es el primer reporte en evaluar esta metodología, la cual puede ser útil para otras aplicaciones en el campo biológico o médico.Palabras clave: células mesenquimales, condrogénesis in vitro, glicosaminoglicanos, ImageJ.