Producción de la enzima recombinante N-acetilgalactosamina-6- sulfato sulfatasa sin péptido señal (GALNSNSP) en Pichia pastoris mediante coexpresión con el gen SUMF1

Abstract

La enfermedad de Morquio A es un error innato del metabolismo causado por la acumulación lisosomal de los glicosaminoglicanos queratán sulfato y condroitin-6- sulfato debido a la deficiencia de la enzima N-acetilgalactosamida-6-sulfato sulfatasa (GALNS). Actualmente existen diversos tratamientos para esta enfermedad, en la que se encuentra la terapia de reemplazo enzimático, mediante el empleo de una enzima producida de forma recombinante. Recientemente se ha demostrado la posibilidad de producir esta enzima en la levadura metilotrófica Pichia pastoris, como una alternativa a la enzima que actualmente se encuentra en estudios de fase clínica III producida en células de mamífero, por lo tanto con miras a la evaluación preclínica y clínica de la enzima producida en P. pastoris es necesario continuar incrementando los valores de actividad enzimática. En este trabajo, se evaluó la coexpresión del gen de la enzima activadora de sulfatasa (SUMF1) con el gen de la enzima GALNS sin el péptido señal (GALNSnsp), mediante la evaluación dos estrategias de cotransformación. Los clones obtenidos fueron confirmados mediante extracción de DNA genómico y PCR para los genes GALNS y SUMF1.Los clones positivos para los dos genes fueron evaluados a escala de 10 ml, obteniendo su mayor actividad específica de 0,24 U/mg. Los mejores clones fueron posteriormente evaluados a escala de 100ml mostrando valores de actividades específicas entre 0,29 U/mg y 0,64 U/mg. Finalmente, dos clones fueron evaluados a escala de 1,7 L obteniéndose actividades máximas de 0,17 y 0,28 U/mg. Mostrando en general mayores valores de actividad especifica que resultados reportados anteriormente en ausencia de SUMF1.