Optimización de la extracción de ADN de Passiflora ligularis para el análisis por medio de marcadores moleculares

Abstract

Objetivo. Estandarizar un protocolo de extracción de ADN eficiente y preciso para Passiflora ligualaris. Materiales y métodos. Se evaluaron dos métodos de extracción de ADN y dos tipos de tejido de Passiflora ligularis en términos de pureza, calidad y cantidad de ADN obtenido, al igual que su aplicabilidad en técnicas moleculares basadas en PCR como los RAPD (Random Amplified Polymorphic DNA). La cuantificación de ADN se realizó mediante espectrofotometría de absorbancia a una longitud de onda de 260nm (A260) usando el espectrofotómetro Beckman Du® 530, de igual manera se obtuvo una estimación de la pureza del ADN por medio de la relación de absorbancia (A260/A280nm). Las variables analizadas en este estudio fueron: el método de extracción (A) y el tipo de tejido (B), con el fin de definir la influencia que éstas tuvieron en la pureza y cantidad de DNA extraído. Para el estudio de estas variables se usó un diseño aleatorio con arreglo factorial 2 x 2. Resultados. La cantidad promedio de ADN obtenido con el método de Mc Couch et al (1988) modificado y Doyle & Doyle (1991) modificado fue 778,9µg/ml y 660,1µg/ml respectivamente para el tejido seco, para el tejido fresco los promedios fueron 1543,3 µg/ml y 820,4 µg/ml respectivamente. Los dos métodos de extracción con tejido fresco produjeron ADN de buena calidad para la amplificación mediante métodos de PCR como los marcadores RAPD. Conclusión. Teniendo en cuenta los resultados obtenidos se propone que con el método de Mc Couch et al (1988) y utilizando tejido foliar fresco se obtiene un ADN de óptima calidad para ser utilizado en los marcadores RAPD. Palabras clave: ADN, extracción, Passiflora ligularis, RAPDAbstractExtraction of high quality DNA of Passiflora ligularis for its analysis with molecular markers. Objective. To standardize a precise and efficient DNA isolation protocol of Passiflora ligularis. Materials and methods. Two methods of DNA extraction and two different tissues of Passiflora ligularis were evaluated in terms of purity, quality and quantity of DNA yield, as well as DNA’s suitability for molecular techniques based on PCR such as RAPDs. Quantification of DNA was done using absorbance spectrophotometry at a wavelength of 260nm (A260) with a Beckman Du ® 530 spectrophotometer. An estimate of the DNA’s purity was obtained using the absorbance ratio (A260 / A280 nm). The variables analyzed in this study were the extraction method (A) and the tissue type (B), in order to define their influence on the purity and quantity of the DNA extracted. For the study of these variables a random design with a 2 x 2 factorial arrangement was used. Results. The average quantities of DNA obtained with the modified method of Mc Couch et al. (1988) and the modified method of Doyle & Doyle (1991) method were 778.9 µg/ml and 660.1 µg/ml respectively for dry tissue. Averages with fresh tissue were 1543.3 µg/ml and 820.4 µg/ml respectively. Conclusion. Based upon our results we suggest the use of Mc Couch et al. (1988) method with fresh leaf tissue to obtain a high quality DNA suitable to be used with RAPDs molecular markers. Key words: DNA, extraction, Passiflora ligularis, RAPDsResumoAperfeiçoamento da extração do DNA de Passiflora ligularis para análise através de marcadores moleculares. Objetivo. Padronizar um protocolo de extração eficiente e preciso do DNA para Passiflora ligularis. Materiais e métodos. Avaliaram-se dois métodos de extração do DNA em dois tipos de tecido de Passiflora ligularis em termos de pureza, qualidade e quantidade do DNA obtido, assim como, sua aplicabilidade em técnicas moleculares baseadas em PCR como os RAPD. A quantificação do DNA realizou-se mediante espectrofotometria de absorbância numa longitude de onda de 260nm (A260) usando o espectrofotômetro Beckman DU® 530, em forma similar, obteve-se uma estimação da pureza do DNA por meio da relação de absorbância (A260/A280nm). As variáveis analisadas neste estudo foram: o método de extração (A) e o tipo de tecido (B), com a finalidade de definir a influência que estas tiveram na pureza e quantidade do DNA extraído. Para o estudo destas variáveis empregou-se um desenho aleatório com arranjo fatorial 2 X 2. Resultados. A quantidade media do DNA obtido com o método de Mc Couch et al (1988) modificado e Doyle & Doyle (1991) modificado, foi 778,9 µg/ml y 660,1 µg/ml respectivamente para o tecido seco; para o tecido fresco as medias foram 1543,3 µg/ml e 820,4 µg/ml respectivamente. Conclusão. Considerando os resultados obtidos propõe-se que com o método de Mc Couch et al (1988) e utilizando tecido folhar fresco obteve-se um DNA de ótima qualidade para ser utilizado nos marcadores RAPD. Palavras chave: DNA, extração, Passiflora ligularis, RAPD.