Producción de la proteína humana recombinante Galns como proteína fusión unida a un péptido de internalización celular para su potencial uso en terapia de reemplazo enzimático de la mucopolisacaridosis IVA

Abstract

En el presente trabajo se realizó la producción de tres proteínas fusión que tuvieran un péptido de internalización celular (CPP) asociado a la enzima humana recombinante N-acetilgalactosamina-6-sulfato sulfatasa (GALNS), una molécula reportera y una cola de histidina, empleando como sistemas de expresión a la bacteria Escherichia coli. Para lo anterior se diseñaron los cebadores específicos necesarios para la amplificación de cada una de las secuencias necesarias para la construcción de los vectores, así como se diseñaron los mapas genéticos de los mismos y el linker flexible de unión entre GALNS y la molécula reportera, utilizando herramientas bioinformáticas. Se emplearon varias técnicas de biología molecular para la obtención de los diferentes vectores, tales como PCR sobrelapante, Touchdown PCR y el método de clonación molecular de Gibson®. Posterior a la verificación de los plásmidos recombinantes, se procedió a la transformación de los mismos en cepas de E. coli BL21 (DE3) y E. coli Rosetta (DE3), a fin de evaluar las diferencias en la expresión de las proteínas fusión y sus actividades enzimáticas. Los resultados obtenidos demuestran que las proteínas fusión producidas son activas, obteniéndose actividades enzimáticas similares a las reportadas previamente, tras evaluar en 1 mL del cultivo de 100 mL, siendo estas de 0.1 U/mL y 0.05 U/mg para la proteína fusión TAT-GALNS-mCherry producida por el clon de Escherichia coli BL21 evaluado; de 0.09 U/mL y 0.089 U/mg para la proteína fusión LMWP-GALNS-mCherry producida por el clon de E. coli Rosetta evaluado y de 0.078 U/mL y 0.079 U/mL para la proteína PDT-GALNS-mCherry producida por el clon de E. coli Rosetta evaluado. Adicionalmente, la evaluación de cultivos control que expresaban proteínas fusión, ya fuera sin la molécula reportera o sin ningún CPP, demostró que dichos fragmentos parecen no tener un efecto negativo en la actividad de la enzima GALNS. Sin embargo, cabe resaltar que estos resultados son aproximaciones debido a que fueron obtenidos al evaluar un único clon de cada cepa para cada constructo y que es necesario optimizar las condiciones de cultivo, lo cual estaba fuera del alcance de este trabajo. Por último, para la purificación de las tres proteínas fusión producidas se empleó la técnica de cromatografía de afinidad con una columna de Sefarosa-Níquel, aprovechando la cola de histidina presente en el extremo C-terminal de las proteínas fusión. Las fracciones obtenidas a partir de la purificación fueron analizadas mediante electroforesis de proteínas (SDS-PAGE) a fin de confirmar los tamaños esperados y a aquellas fracciones que presentaron una mayor pureza se determinó su actividad enzimática. Este estudio representa el primer reporte en la producción de una proteína fusión activa entre un CPP y GALNS, ofreciendo información importante para su posible uso como alternativa para el tratamiento de Mucopolisacarosis IVA y otras enfermedades lisosomales.