Producción de fenilalanina hidroxilasa en lactobacillus plantarum como posible vehículo de entrega gastrointestinal

Abstract

La fenilcetonuria (PKU) es la amlnoaddopatia más frecuentes entre los caucásicos, se produce debido a un defecto de la fenilalanina hidroxllasa (PAH), que cataliza la conversión de fenilalanina (Phe) en tirosina. Una PAH defectuosa provoca la acumulación de Phe. niveles altos de Phe resultan en generación del metabollto fenilpiruvato el cual tiene un efecto neurotóxlco, adiclonalmente Phe compite por los transportadores de aminoácidos grandes neutros en la barrera hematoencefállca de manera que su exceso evita la entrada de otros aminoácidos de este tipo haciendo que estos estén deficientes a nivel de sistema nervioso central lo que causa un déficit en la síntesis de algunos neurotransmlsores. El tratamiento para esta enfermedad Incluye dietas, que se deben mantener a lo largo de toda la vida y por tanto resultan incomodas para los pacientes, suplementación con tetrahidrobiopterlna. la cual depende de la mutación (no todas son sensibles), ó terapia de reemplazo enzimàtico administrada vía parenteral, la cual aún se encuentra en ensayos clínicos y presenta efectos adversos. El objetivo de este trabajo es evaluar proteínas fusión basadas en la PAH producidas en una cepa de L. plantarum. Estas proteínas incluyen una proteina fluorescente verde mejorada (EGFP), como reportero, y contienen péptidos para: 1) la secreción de lactobacllos. 2) el transporte a través de la barrera gastrointestinal, y 3) entrada a células hepáticas. Estos constructos se insertaron en el vector de expresión pSIP501. Las células de L. plantarum se transformaron por electroporaclón y la producción de las proteínas fusión fue evaluada por espectrofluorometría en el extracto crudo de los cultivos. Los mejores clones fueron escogidos para evaluar su extracto en células CaCo2 cultivadas en placas de Transwell (1x104 células por pozo) con el fin de determinar la capacidad de las proteínas para cruzar la membrana epitelial gastrointestinal. La cepa de L. plantarum produjo y secretó con éxito las proteínas fusión recombinantes. Estas proteínas fueron capaces de cruzar una monocapa totalmente diferenciado de las células CaCo2.