Las superficies y diferentes elementos hospitalarios, pueden ser colonizados por microorganismos potencialmente patógenos que pueden ocasionar infecciones intrahospitalarias (IIH). El objetivo de este estudio fue identificar la microbiota presente en superficies y en el ambiente de la Unidad de Cuidados Intensivos de una institución hospitalaria de tercer nivel. Para superficies se tomaron muestras por el método de frotis y para ambientes se utilizó el método de placa expuesta. Se tomaron 218 muestras para bacterias y levaduras, y 52 muestras para mohos; el 50% de las muestras fueron tomadas en pre-desinfección y el 50% en post-desinfección. Adicionalmente se tomaron 30 muestras de control interno de un área no controlada. Para pre-desinfección se obtuvo S. aureus (28%), Rhodotorula sp. (50%) y Penicillium sp. (72%). A nivel de post-desinfección se aisló P. aeruginosa multidrogoresistente, C. albicans y Penicillium sp. Por otro lado, en las muestras de control interno se encontró E. coli, y S. aureus. En la microbiota ambiental de la UCI, en pre-desinfección, se aisló S. aureus resistente a la meticilina (SAMR), mientras que en post-desinfección se aisló C. albicans y P. aeruginosa. Como conclusión, tanto en la UCI como en las áreas de control evaluadas, se aisló E. coli y S. aureus, lo que indica que estos microorganismos pertenecen a la microbiota circulante de la clínica. Los hongos encontrados en el rastreo, son normales del área ambiental. Por último, se resalta la importancia de la estandarización de los procesos de desinfección y la rotación de los desinfectantes para prevenir y controlar la aparición de IIH.