| dc.description.abstract | La mucopolisacaridosis tipo IIIB (MPS IIIB), o síndrome de Sanfilippo tipo B, es un trastorno de almacenamiento lisosomal autosómico recesivo causado por deficiencia en la actividad de la enzima lisosomal α-N-acetilglucosaminidasa (NAGLU), provocando la acumulación del glicosaminoglicano heparán sulfato (HS). Los pacientes que padecen esta enfermedad presentan principalmente alteraciones a nivel del sistema nervioso central, además de anomalías en otros órganos y tejidos. Actualmente, no existen terapias aprobadas para este trastorno, por lo que diferentes alternativas terapéuticas están siendo evaluadas. La terapia de reemplazo enzimático (TRE) permite la reducción de los sustratos acumulados en el lisosoma a través del suministro de proteínas recombinantes producidas en diferentes sistemas de expresión. La TRE ha sido aprobada para 11 enfermedades lisosomales, para las cuales se han utilizado sistemas de expresión como células de mamífero, plantas y animales. A la fecha, la enzima NAGLU recombinante solo ha sido producida de forma exitosa en células de ovario de hámster chino (CHO). Para el caso de microorganismos como las levaduras aún no se ha obtenido esta enzima recombinante de forma activa empleando este sistema de expresión. Sin embargo, este sistema de expresión ha sido ampliamente usado para la expresión de proteínas de origen humano para terapia, debido a que presenta ventajas como su fácil manipulación y bajo costo de producción, su capacidad de realizar modificaciones postraduccionales similares a la proteína nativa humana y la posibilidad de obtener la proteína de forma extracelular, lo cual favorece los procesos de purificación. En el presente estudio se evaluó la producción de la enzima NAGLU recombinante en la levadura metilotrófica Komagataella phaffii (Pichia pastoris) GS115 como sistema de expresión. La cepa fue transformada con el vector pPICZαA-NAGLU, el cual permite la expresión del gen NAGLU bajo el control del promotor AOX1. La presencia del inserto fue verificada por PCR en diez clones obtenidos en medio suplementado con zeocina. La expresión de la proteína recombinante fue inicialmente evaluada a escala de 10 mL, y aquellos clones que presentaron mayor actividad fueron usados para producir la proteína a escala de 100 mL, escala en la cual dos clones mostraron valores de actividad de 0,074 U/mL y 0,121 U/mL después de 72 horas de inducción. El clon con mejor actividad a 100 mL fue escalado a 400 mL mostrando una actividad de 0,187 U/mL a las 72 horas de cultivo. Finalmente, el extracto crudo fue clarificado a través de diferentes poros de membrana, concentrado y diafiltrado para ser purificado por medio de cromatografía de afinidad. Las fracciones recolectadas mostraron actividades entre 0,195 – 0,242 U/mL, y la presencia de la proteína fue verificada mediante SDS-PAGE y western-blot. Las fracciones fueron desalinizadas, concentradas y diafiltradas en citrato de sodio obteniendo una actividad específica de 0,438 U/mg. Posteriormente, la enzima recombinante NAGLU purificada se usó para realizar ensayos in-vitro empleando fibroblastos de pacientes MPS IIIB. Los resultados mostraron que la proteína fue capturada en un proceso mediado por receptores manosa y manosa-6-fosfato, permitiendo la reducción de la masa lisosomal. Estos resultados representan la primera evidencia de la posibilidad de emplear la levadura K. phaffii como sistema de expresión para la producción de NAGLU humana recombinante, como potencial herramienta para el estudio y continuo desarrollo de una TRE para pacientes con MPS IIIB. | spa |
