Análisis del efecto de la α-Solanina en las características citomorfológicas de células vivas adheridas y su relación con la expresión del gen Shroom3

Abstract

Dado el actual interés de diferentes investigadores hacia la α-solanina como potencial sustancia anticancerígena y la controversia que existe en la literatura científica sobre la posible citotoxicidad de la α-Solanina, así como las alteraciones que la sustancia provoca sobre diferentes células, se consideró de gran interés analizar los efectos que el glicoalcaloide produce en Células Troncales de Medula Ósea (CTMO).

Con este fin se propuso la siguiente hipótesis de investigación; La observación y análisis de los cambios morfológicos resultado de la exposición de las CTMO a diferentes concentraciones y tiempos, permitirá proponer un modelo reproducible y unos patrones de comparación cualitativa que permitan analizar cambios de citotoxicidad básica mediante microscopia óptica en células vivas en cultivo.

Este trabajo se realizó cumpliendo tres niveles de resolución: el primero, resolución macro, que corresponde a presentar la importancia de la α-solanina para la salud humana y expone la importancia de su análisis (Artículo publicado). En segundo lugar, resuelve dos problemas con los que nos enfrentamos al examinar el efecto morfológico que ocasiona el glicoalcaloide en este tipo de células mesenquimales inmunotipificadas, vivas y adheridas. Por un lado, no estaba descrita una técnica colorimétrica sencilla que permitiera visualizar en células vivas adheridas el efecto producido por el glicoalcaloide y por otro la ausencia en la literatura revisada, de la descripción de los rangos no letales, de concentración y tiempo de exposición al glicoalcaloide.

Por estas razones se propuso validar la utilización de la tinta china como alternativa directa, nítida, económica y viable en el análisis del efecto ocasionado por la exposición de las células troncales de medula ósea de rata (CTMO) a dos concentraciones del glicoalcaloide, contenidas entre los rangos de experimentación resultado del análisis de referencias bibliográficas. (Artículo publicado).

Por otro lado, no había evidencia en la literatura de las concentraciones del glicoalcaloide que permitieran evidenciar en este tipo de células mesenquimales, cambios morfológicos básicos ; 1. Cambios de forma de las células (Homogeneidad y Heterogeneidad celular predominante), 2. Cambios en tamaño y condensación intracitoplasmática, 3. Visualización o no de la membrana celular, 4. Presencia de prolongaciones o espículas modificadas en número y longitud, 5. Características de Núcleos, 6. Número de Nucléolos y 7. Presencia o no de vacuolas intracitoplasmáticas. (Artículo Publicado).

Los cambios morfológicos evidenciados con la técnica propuesta y a las concentraciones sugeridas, fueron entonces validados en células vivas adheridas mediante la observación de la proteína globular actina, por medio de microscopia confocal y en células no adheridas, por medio del análisis de viabilidad (MTS-utilizando espectrofotometría), proliferación (CFSE) y apoptosis (Anexina V/7AAD) utilizando Citometría de Flujo. Los resultados demostraron que la α- Solanina produce cambios morfológicos visibles en microscopia convencional mayormente en las células tratadas durante 24 h con α- Solanina a una concentración de 2 μM, modificando parámetros relacionados con citotoxicidad basal, como forma, tamaño y longitud de espículas (Artículo Sometido) , así como también produciendo efectos característicos en núcleo, efectos característicos en la distribución de los microfilamentos de actina e inhibiendo la proliferación celular, promoviendo la apoptosis, y la autofagia (Artículo en revisión).

Para el tercer nivel de resolución, se propuso el análisis de la posible relación entre el glicoalcaloide α-solanina y la expresión del gen Shroom3 descrito como regulador de la morfología celular en más de veinte tipos celulares incluidas las mesenquimales. Para esto, se expusieron células troncales de medula ósea de rata a dos concentraciones diferentes del glicoalcaloide y se realizó extracción de ARN y reacción cuantitativa en cadena de la polimerasa en tiempo real (qRT-PCR).

Los resultados obtenidos en esta parte del trabajo proponen un vínculo entre el gen Shroom3 y la exposición a la α-Solanina, debido a que se encontró que el glicoalcaloide regula negativamente la expresión del gen de una manera dependiente de la concentración y del tiempo.

En todos los niveles de resolución del trabajo se utilizaron células troncales de medula ósea de rata hembra cepa Lewis entre 2 y 4 meses de edad de la cepa Lewis alojadas en la Sala de Experimentación Animal de la Facultad de Odontología de Pontificia Universidad Javeriana. Estas células fueron obtenidas, extraídas, inmunotipificadas, caracterizadas y cultivadas en el Centro de Investigaciones Odontológicas bajo sus propios protocolos (en proceso de publicación según sus investigadores Jaramillo L., Duran C.). La α-solanina fue obtenida comercialmente.