Clonación y expresión del gen optimizado de la enzima iduronato 2-sulfato sulfatasa humana (IDS) en Pichia pastoris

Abstract

La mucopoliscaridosis tipo II (MPS II) o Síndrome de Hunter, es una enfermedad hereditaria de almacenamiento lisosomal ligada al cromosoma X, causada por la deficiencia de la enzima Iduronato 2-sulfato sulfatasa (IDS). Actualmente la producción de esta enzima para la terapia de reemplazo enzimático se realiza en células de mamífero y representa costos altamente elevados. La levadura Pichia pastoris, como sistema de expresión de proteínas recombinantes presenta ventajas para la producción de este tipo de enzimas. En este utilizó el gen de IDS optimizado que fue desarrollado mediante el uso de la herramienta Mr. Geneª y se encargó la síntesis a la compañía GENEARTª con el objetivo de incrementar los rendimientos hasta ahora reportados. Se realizó la clonación de este gen en P. pastoris GS115, obteniéndose 20 clones, los cuales fueron evaluados a escala de 10 ml de cultivo durante 96 horas de inducción a 30ÀC y pH 4.5. La concentración de proteínas y la actividad enzimática en el medio de cultivo, fueron medidas cada 24 horas. La mayor actividad observada fue de 42,5 U¨mg-1 a las 48 h (clon 12) y de 49,76 U¨mg-1 a las 72 h (clon 13). Se evaluaron los clones que presentaron mayor actividad a 10 mL (Clones 8,11,12,13,14 y 15) a volumen de 100 mL observando valores máximos de actividad con el clon 8 y 13 de 6.4 y 5.99 U/mg de proteína respectivamente, a las 48 horas de inducción. Adicionalmente se evaluó el clon 13 a escala de 1500 mL obteniendo valores de actividad 7.9 U/mg proteína total, a temperatura de 28ºC, agitación 900 rpm. Estos resultados preliminares sugieren que la optimización del gen de IDS para P. pastoris tiene un efecto positivo sobre la actividad de la enzima comparada con resultados obtenidos en trabajos previos, mostrando la factibilidad de usar este sistema de expresión como alternativa para la producción de la IDS recombinante activa para el futuro tratamiento de la Mucopolisacaridosis tipo II. Sin embargo, es necesario analizar los factores que pueden dar la posible producción de proteína no activa con el objetivo de mejorar la expresión a diferentes escalas.