Estandarización de la técnica para la evaluación del estallido respiratorio de células fagocíticas mediante citometría de flujo

Abstract

La Enfermedad Granulomatosa Crónica (EGC) es una inmunodeficiencia primaria caracterizada por un incremento en la susceptibilidad a infecciones fúngicas y bacterianas a repetición, causado por mutaciones en los genes que codifican las subunidades de la enzima adenina dinucleótido fosfato oxidasa (NADPH oxidasa). Esta enzima es un complejo multimérico presente en la membrana de células fagocíticas, encargada de catalizar la formación de radical súper-óxido, especies reactivas de oxigeno (ROS) y ácido hipocloroso, importantes para la defensa del huésped contra microorganismos patógenos. Existen diferentes técnicas diagnósticas para esta enfermedad dentro de las que se encuentra la Citometría de flujo, técnica altamente sensible, rápida, sencilla, y confiable comparada con otras técnicas como la reducción de nitroazul de tetrazolium (NBT) que es poco sensible y altamente susceptible a errores debido a su alta dependencia de la experticia del observador. Es por esto que en el este estudio tiene como fin estandarizar la técnica de la Dihidrorodamina 123, por Citometría de flujo, para la determinación de la fagocitosis y el estallido respiratorio en poblaciones de monocitos y polimorfonucleares de individuos sanos, para posteriormente poder utilizarla como una técnica de rutina para el estudio y diagnóstico de la EGC. Para esto se evaluaron diferentes aspectos que podían llegar a influir en el adecuado análisis de los resultados del estallido respiratorio de los fagocitos como son: la efectividad de la lisis de glóbulos rojos para un análisis apropiado, la óptima concentración del activador Forbol 12-miristato 13-acetato (PMA), la concentración del fluorocromo Dihidrorodamina 123, y el tipo de anticoagulante a utilizar. Se evaluaron muestras de sangre periférica (SP) de nueve personas voluntarias, sin antecedentes de EGC, con valores normales de neutrófilos, eosinófilos y monocitos. Se utilizó como lisante de los glóbulos rojos el Buffer de lisis de amonio, el cual solo se pudo utilizar en forma adecuada cuando cada uno de sus componentes fue preparado en concentración 10X y conservado estéril a 2°C; como activador celular se utilizaron tres concentraciones diferentes de PMA (1, 5 y 10μg/mL); y se ensayaron tres distintas concentraciones del fluorocromo DHR123 (1, 3 y 5μg/mL). Para determinar cual concentración tanto del activador como del fluorocromo era la adecuada para el análisis del estallido respiratorio en las células fagocíticas, se tuvieron en cuenta tres criterios: el porcentaje de celularidad total, el canal medio de fluorescencia (CMF) en las poblaciones leucocitarias y la adecuada discriminación de estas poblaciones teniendo en cuenta los parámetros de tamaño (Forward Scatter –FSC-) versus granularidad (Side Scatter –SSC-). Además se utilizaron como anticoagulantes el ácido etilen-diamino-tetra-acético (EDTA) y la heparina de litio, y se evaluó si el uso del anticoagulante influye en la actividad oxidativa de las células fagocíticas. Las muestras se procesaron y adquirieron en un citómetro de flujo FACSCalibur, y fueron analizadas en un tiempo no superior a 4 horas pasada la toma de la muestra. El análisis estadístico de los datos se realizó empleando el software estadístico SPSS versión 17, en donde se calcularon las medias, desviación estándar y rangos, y se compararon las medias aplicando el test de Mann Whitney. Se consideraron como diferencias significativas cuando p<0,05. A partir de estos análisis, se concluyó que la concentración de PMA afecta el porcentaje de celularidad total de la SP comparando la sangre lisada con los diferentes tratamientos (1, 5 y 10μg/mL) siendo más tóxica la concentración más alta (p: 0,043). Pero respecto al CMF, la PMA no mostro cambios significativos entre cada tratamiento (p>0,05). Para el caso de la DHR 123, se observó que las diferentes concentraciones de este fluorocromo no afectan la celularidad (p>0.05), pero el tratamiento con 1μg/mL es el que presenta el mayor porcentaje de celularidad (91,6%). Sin embargo, para el caso de el CMF, se observan diferencias significativas (p<0,05) en las cuatro poblaciones celulares al compararlas con sangre lisada. 6 Con todo lo anterior se llegó a la conclusión que la óóptima concentración para el activador PMA es la de 1μg/mL, y así mismo la concentración adecuada para la DHR123 es de 1μg/mL, ya que con estas concentraciones es en donde se puede hacer una mejor discriminación de las poblaciones celulares, y en donde la celularidad se ve menos afectada por el tratamiento con dichos reactivos. El análisis de la influencia de los anticoagulantes en la actividad oxidativa, muestra que el uso de EDTA y Heparina de litio no altera el estallido respiratorio de las células fagocíticas, al comparar los CMF en las poblaciones leucocitarias (p>0,05), y además que el uso de éstos no altera la celularidad de las muestras.