Expresión de la enzima β-Hexosaminidasa humana recombinante en Pichia pastoris regulada bajo el promotor constitutivo GAP

Abstract

Las β-hexosaminidasas (EC 3.2.1.52) son enzimas lisosomales que juegan un papel importante en el catabolismo lisosomal de los glicoesfingolípidos. Los defectos en sus vías de degradación están asociados con enfermedades neurodegenerativas que incluyen la enfermedad de Tay-Sachs y Sandhoff. Actualmente, estos trastornos son incurables, razón por la cual se han adelantado estudios en una terapia de reemplazo enzimático. La levadura metilotrófica Pichia pastoris ha despertado un interés cada vez mayor para la producción de proteínas recombinantes, ya que se ha reportado ampliamente este microorganismo como un sistema de expresión eucariota eficiente, debido a la disponibilidad de promotores fuertes como el alcohol deshidrogenasa 1 (AOX1). Sin embargo, uno de los principales inconvenientes que actualmente se presenta con el uso de este promotor, radica en la legislación Colombiana, en la cual, según el artículo 4º del Decreto 2272 de 1991, se encuentra vigente la limitación a la importación de metanol. Por esta razón, en los últimos años se han hecho esfuerzos importantes para reducir el uso de metanol y desarrollar promotores alternativos, como el promotor GAP, un promotor constitutivo fuerte, en el cual el gen foráneo se expresa asociado con el crecimiento celular. Con base en lo anterior, el objetivo de este estudio consiste en evaluar la expresión de la enzima β-Hexosaminidasa humana Recombinante en Pichia pastoris empleando el promotor constitutivo GAP, con el fin de reducir el uso de metanol durante su producción, y continuar trabajando en el desarrollo de una la terapia de reemplazo enzimático como una alternativa al tratamiento para las enfermedades de Tay-Sachs y Sandhoff. Se evaluaron diferentes condiciones de cultivo a escala de 100 mL y escala de biorreactor, encontrando que el promotor AOX1 resulta más eficiente para la producción de la enzima.